醬油漲袋、漲瓶中產氣菌的檢測探討
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醬油漲袋、漲瓶中產氣菌的檢測探討
樊君,  羅紅剛,  王惠芳,  周紅梅
(四川省調味品添加劑工程技術研究中心,四川 眉山 620010)
摘  要:敘述了對醬油漲袋、漲瓶中產氣菌的檢測方法,通過不同培養基和判定方法,可預測產品是否會出現貨架期漲袋、漲瓶現象,經生產企業實踐證明,杜絕了醬油產氣的質量問題。具有一定的實用價值。
關  鍵  詞:醬油;產氣菌;漲袋;漲瓶
Detectionofsoy sauce bottle up bag, up gas producing bacteria
FAN Jun, LUO Hong-gang, WANG Hui-fang, ZHOU Hong-mei
(Sichuan Province flavoring additives engineering technology research center of Sichuan, Meishan 620010,China)
Abstract: The detection method of soy sauce bottle up bag, rose aerogen, through different media and the determination method, can predict the product whether there will be ashelf up bag, up the bottle, certified productionen terprise practice, to eliminate thequality problems of gas production of soy sauce. It has certain practical value.
Key words: soy sauce;gas bottle explosion rose bag; rose bottle
醬油是以大豆、小麥等為原料,經原料預處理、制曲、發酵、壓榨取油及精制殺菌等工藝生產出來的調味品,營養極其豐富,主要營養成份包括氨基酸、可溶性蛋白質、糖類、酸類等。這些營養極易被各種菌利用,特別是產氣菌在夏季氣溫高的時候極易發生,產品雖然在灌裝之前已通過了滅菌,其衛生指標也符合了釀造醬油國家衛生標準,但還殘留了一些微生物,特別是產氣雜菌,對產品的保質期影響巨大。針對客戶反映的事故產品即漲袋、漲瓶醬油的微生物檢驗和進行菌學分析,發現醬油在不同的培養基上出現了菌落總數中從未有過的新形態特征菌落,由此進行了分離、培養和鑒定,并探討通過醬油微生物菌落不同形態以及在不同培養基條件下的反應特征來判定和產氣檢驗,使產品在灌裝入庫前的質量可得到有效控制,從而杜絕產品在存放或貨架期出現漲袋、漲瓶的現象,實踐證明,有較好的實用價值和可操作性。
1  材料和方法
1.1材料
藥品和原料:蛋白胨,酵母膏 ,葡萄糖,胰蛋白胨,酵母浸膏,葡萄糖,瓊脂,土豆。
設備:滅菌鍋,顯微鏡,超凈工作臺等。
試劑:甲基紅指示劑
1.2方法
1.2.1液體培養基配比(代號Y1):蛋白胨10g ,酵母膏5g ,葡萄糖1g ,蒸餾水1000ml,PH自然(5.2±0.2)
1.2.1.1配制方法:稱取上述成分,加入蒸餾水中攪拌溶解后,定容到1000ml,分裝到有玻璃小倒管的試管中,每管27ml,包扎,0.1MPa121℃恒溫滅菌15min。
1.2.1.2接種培養:空白樣1根試管,每個檢測樣9根試管。另取裝有5—6粒玻璃珠的300
—500ml無菌三角瓶,加入待測樣100—250ml充分振蕩搖勻,向裝有27ml培養基的每根試管中接入3ml待測原樣,搖勻后于36℃培養48h。
1.2.1.3培養觀察
培養48h,沿試管壁緩慢加入甲基紅指示劑,仔細觀察培養液上層,注意不要搖動試管,若培養液上層變為黃色,則有產氣菌;培養48h,沿試管壁緩慢加入甲基紅指示劑,仔細觀察培養液上層,注意不要搖動試管,若培養液上層變為紅色且倒管內無氣泡,則無產氣菌;培養48h,倒管內有小氣泡,則有產氣菌。
1.2.1.4判定
檢測樣倒管3/9產氣(計數方法同大腸菌群的計數法),無論檢測樣表面有無菌膜,該批樣均可判定為產氣樣;檢測樣8/9長菌膜,8/9菌膜厚度1mm,且加入甲基紅8/9變紅,倒管無氣泡,該批樣均可判定為產氣樣。
1.2.2固體培養基
1.2.2.1培養基配比(代號Y2):胰蛋白胨5.0g,酵母浸膏2.5g,葡萄糖1.0g,瓊脂20.0g,蒸餾水1000ml,PH7.0±0.2
1.2.2.2分裝滅菌:稱取上述培養基組分,加水溶解(瓊脂加入三角瓶)并定容到1000ml,分裝到300—500ml三角瓶中,0.1MPa121℃恒溫滅菌30min。待培養基溫度降至40—45℃時倒入無菌培養皿中,待用。
1.2.2.3接種培養:將待測樣或梯度稀釋樣,接種到培養皿上,于36℃恒溫培養48h,觀察培養皿上菌落特征,并做鏡檢。
1.3漲袋、漲瓶醬油中檢測到的幾種產氣菌的菌落特征
1.3.1產氣菌M1菌落特征:菌落大、灰白色、不規則、不透明、皺褶、生長在培養基里面,中間有一小液泡凸起,繼而癟縮(見下面M1菌落圖片);鏡檢特征:芽孢桿菌;液體培養特征:試管液面長菌膜(菌膜灰白色、有皺褶),下面清澈(但形成菌膜之前或菌膜下沉時液體渾濁);加入甲基紅液面呈黃色;有時菌膜處現氣泡,但倒管無氣泡。

1.3.2產氣菌M2菌落特征:菌落大、白色、樹根狀、不透明、皺褶、生長在培養基表面,象松花皮蛋的松花狀,繼續培養長成樹根狀(見下面M2菌落圖片)。鏡檢特征:芽孢桿菌;液體培養特征:試管液面長菌膜(菌膜灰白色、有皺褶),下面清澈(但形成菌膜之前或菌膜下沉時液體渾濁);加入甲基紅液面呈黃色;有時菌膜處現氣泡,但倒管無氣泡。

1.3.3產氣菌M3菌落特征:菌落大、不規則、不透明、皺褶、生長在培養基表面,中心有粉紅色圓點,整個菌落略顯粉紅色見下面M3菌落圖片);鏡檢特征:芽孢桿菌;液體培養特征:試管液面長菌膜(菌膜灰白色、有皺褶),下面清澈(但形成菌膜之前或菌膜下沉時液體渾濁);加入甲基紅液面呈黃色;有時菌膜處現氣泡,但倒管無氣泡。

1.3.4產氣菌M5菌落特征:菌落小、不規則、不透明、乳白色、生長在培養基內部,繼續培養長出培養基表面(見下面M5圖片)。鏡檢特征:芽孢桿菌;液體培養特征:試管液面長菌膜(菌膜灰白色、有皺褶),下面清澈(但形成菌膜之前或菌膜下沉時液體渾濁);加入甲基紅液面呈黃色;有時菌膜處現氣泡,但倒管無氣泡。

1.3.5產氣菌M6菌落特征:菌落大、不規則、不透明、白色、扁平一片、生長在培養基與平皿之間,繼續培養長出培養基表面(見下面M6菌落圖片)。鏡檢特征:芽孢桿菌;液體培養特征:試管液面長菌膜(菌膜灰白色、有皺褶),下面清澈(但形成菌膜之前或菌膜下沉時液體渾濁);加入甲基紅液面呈黃色;有時菌膜處現氣泡,但倒管無氣泡。

1.3.6產氣菌M7菌落特征:菌落大小適中、透明、白色、圓形、凸起、生長在培養基表面(見下面M7菌落圖片)。

鏡檢特征:非芽孢桿菌,短桿菌(鏡檢圖片如下)。

液體培養特征:試管液面無菌膜;加入甲基紅液面呈紅色;倒管有氣泡。

1.4液體培養基配比(代號Y3):土豆(去皮切塊)300g,葡萄糖20g,蒸餾水1000ml,PH自然(4.5-5.0)
1.4.1制備方法:稱取去皮切塊的土豆,加水1000ml,煮沸維持10-20min,用多層紗布過濾,濾液加水定容到1000ml,加入葡萄糖攪拌溶解,試管內放入倒置的小倒管,然后分裝,每管27ml,包扎,0.1MPa121℃恒溫滅菌20min。
1.4.2接種培養:空白樣1根試管,每個檢測樣9根試管。取裝有5—6粒玻璃珠的300—500ml無菌三角瓶,加入待測樣100—250ml充分振蕩搖勻,向裝有27ml培養基的每根試管中接入3ml待測原樣,搖勻后于36℃培養72h或最好30℃培養5d。
1.4.3觀察記錄:培養3-5d,如倒管有氣泡,則判斷有產氣菌。
1.4.4判定:空白樣管倒管無氣泡,檢測樣倒管3/9產氣(參考GB大腸菌群計數法),無論檢測樣表面有無菌膜,均判定為有酵母菌。
1.5固體培養基配制(代號Y4):土豆(去皮切塊)300g,葡萄糖20g,瓊脂20g,蒸餾水1000ml,PH自然(4.5-5.0)
1.5.1制備方法:稱取去皮切塊的土豆,加水1000ml,煮沸維持10-20min,用多層紗布過濾,濾液加水定容到1000ml,加入葡萄糖攪拌溶解,調PH4.5-5.0(瓊脂加入三角瓶中)。
1.5.2分裝滅菌:稱取上述培養基分裝到300—500ml三角瓶,于0.1MPa121℃恒溫滅菌30min。待培養基溫度降至40-45℃時倒入無菌培養皿中,并做鏡檢。
1.5.3接種培養:將待測樣或梯度稀釋樣,接種到培養皿上,于36℃培養72h或最好30℃培養5d,觀察培養皿上菌落特征,并做鏡檢。
1.6產氣菌M8菌落特征:菌落直徑小、白色、先生長在培養基中間繼而長出表面,有皺褶(見下面M8菌落圖片);鏡檢特征:橢圓形、臘腸型(鏡檢圖片如下);液體培養特征:液面有菌膜,倒管有氣泡。

1.7產氣菌M9菌落特征:菌落直徑中、白色、生長在培養基表面,近圓形菌落中心有小凸起,培養時間越長皺褶越明顯(見下面M9菌落圖片)。鏡檢特征:多為臘腸型;液體培養特征:液面有菌膜,倒管有氣泡;鏡檢特征:多為臘腸型;液體培養特征:液面有菌膜,倒管有氣泡。

1.8產氣菌M10菌落特征:菌落直徑中、白色、生長在培養基表面,近圓形凸起菌落上載有一小凸起,一開始皺褶明顯(見下面M10菌落圖片)。

鏡檢特征:橢圓形,臘腸形;液體培養特征:液面有菌膜,倒管有氣泡;

1.9產氣細長桿菌M11菌落特征:菌落直徑大、灰白色、邊緣不整齊、有皺褶(見下面M11菌落圖片)。

鏡檢特征:棒桿狀,臘腸形(鏡檢圖片如下)。液面有菌膜,倒管有氣泡。

2  結果與分析

2.1不同細菌分解利用糖的能力不同,有的能利用,有的不能利用,能利用者,有的產酸又產氣,有的只產酸不產氣。因此,細菌能否利用糖以及利用糖表現出是否產酸產氣作為細菌分類鑒定的依據。觀察是否產酸可在發酵培養基中加入指示劑溴甲酚綠(PH值在5.2以下呈黃色,PH值在6.8以上呈紫色),培養后根據指示劑的顏色變化來判斷。
2.2 對于兼氧型的產氣細菌,培養過程在液體里面生長繁殖,產氣的氣體會進入倒管,因此,觀察是否產氣可在發酵培養基中倒置放入杜氏小管,培養后觀察倒置小管中有無氣泡。
2.3 對于好氧型的產氣菌,培養過程在液體培養基的表面或上部生長繁殖,產氣的氣體不會進入倒管。這類產氣菌在糖代謝過程中,分解葡萄糖產酸量少,或產生的酸進一步轉化為其他物質(如醇、酮、醚、氣體和水等),培養基的酸度在PH6.2以上,加入甲基紅指示劑呈黃色,因此觀察培養基的變色情況來作為判定產氣菌的依據。甲基紅為酸性指示劑,PH范圍4.4—6.0,在PH5.0以下,隨酸度而增強紅色,在PH5.0以上,則隨堿度而增強黃色,在PH5.0或上下接近時,可能變色不夠明顯,此時應延長培養時間,重復試驗。
3  結論
用Y1液體培養基和Y2固體培養基均可檢測和判斷醬油漲袋、漲瓶的細菌型產氣菌,M1-M6菌均為芽孢桿菌,甲基紅實驗呈黃色,倒管無氣泡;M7為非芽孢桿菌,甲基紅實驗呈紅色,倒管有氣泡。用Y2液體培養基和Y4固體培養基均可檢測和判斷醬油漲袋、漲瓶中的酵母菌和細長細菌產氣菌,M8-M10菌為酵母菌,M11為細長細菌。在實際應用中,如果產品中檢出此類菌,均有漲袋、漲瓶風險。在生產中,對前期醬油在灌裝入庫時進行抽測,可以很好的預判醬油的貨架期,減少經濟損失。



參考文獻:
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